多重染色问答系列1

　　泰立瑞病理（泰瑞镜下）Q1：是否多重荧光免疫染色的panel越大越好？
　　A1：近年来，多个多重组织染色成像技术平台出现，这些平台使用抗体标记技术与高分辨率组织成像技术，与传统的免疫组织化学（IHC）技术相比，可以在同一张玻片上同时可视化多个标记的生物标志物。这种多重免疫荧光染色技术及其相关成像技术使研究人员和临床医生能够回答更复杂的问题，并评估许多个标志物或细胞之间的相互作用。例如，研究免疫系统如何与肿瘤发生相互作用等复杂生物现象。南京泰立瑞的技术人员经常接到咨询，询问：我应该对一张片子检测多少个标记物？是否检测标记物越多越好？是否产生数据越多越好？
　　虽然目前的多个多重组织染色成像平台可以在单个玻片上同时评估超过30个或更多标记物，但最重要是你要问自己多少标记物对你的研究问题是最佳的。要生成多重组织染色及成像数据，主要需要试剂（例如抗体）和成像时间，这两者都具有明确定义的成本和代价。所以，问题应该转化为如何有效利用标记物和资源，最终将其研究问题缩减到尽可能少的标记和尽可能低的成像分辨率。
　　一般来说，在基础研究和机制发现阶段，研究人员可能不知道他们正在寻找什么，尽量从宝贵的样本中获取尽可能多的数据、检测更多的标志物，在有充分资源的前提下，themore，thebetter
　　从这些大量的数据中，研究人员可以揭示其数据背后独特的生物标志物关系，并确定哪些生物标志物是真正重要的，例如使用主成分分析法。使用这个迭代过程，研究人员可以将其生物标志物大幅减少到更易管理和经济的水平，甚至可能只需要同时成像34个标记，泰立瑞预测38个标志物panel才可能是多重免疫荧光染色未来临床应用的主流大panel的终点往往是小panel，即便从纯学术的开放性研究角度来看，也需要注意平衡多重组织成像所获得信息的价值和成本。毕竟更多数据总是需要付出代价，例如试剂、抗体等和时间成本，更多的数据并不总是更好的。因此，研究人员应该尽量减少panel的大小和成像分辨率，具体取决于他们的研究问题。
　　总体而言，需要认识到多重免疫荧光技术提高研究和解答复杂问题的潜力，但同时也要认识到更多的数据并不总是更好的，也并不适用于每个研究问题。因此，研究人员应该谨慎考虑使用多重组织成像的成本效益，并且在研究进展中尽可能减少标记的数量。
　　Q2：我应该选择显色多重免疫组织化学（chromogenicmultipleximmunohistochemistry）还是基于荧光的多重免疫荧光系统（multipleximmunofluorescence）？
　　A2：选择显色多重免疫组织化学的一个关键因素是染色标本需要存档的时间长度。通常，一项研究会持续数年，在项目实施过程中，项目研究人员可能从实验室来来去去。显色多重免疫组织化学可以让你将标本保存更长时间，这样就可以在项目需要时重新读片，或者以后拍摄更高倍率的图像，这在免疫荧光中是不可能的，因为荧光染色会随着时间的推移而失去清晰度，免疫荧光染色的衰减、消散在染色几周或几个月后发生，使该标本无法再进行进一步成像，这意味着必须重复实验。
　　显色多重免疫组织化学法的另一个优势是，它可以让你真正了解组织结构和形态，无论是邻近的血管、软骨、骨骼等。这些结构在免疫荧光中可能不显现，除非你做了荧光染色成像后又做了HE染色，否则你只能看到荧光染色的图像。
　　显色多重免疫组织化学法的可及性也更好，荧光显微镜及所需的过滤器和设备远远没有明场普通光学显微镜普遍。此外，基于免疫荧光的系统往往需要更长的时间来建立和优化。
　　当然，这并不意味着显色免疫组织化学法比免疫荧光更好也许存档对你来说并不重要，但你真的想看看超过3个标志物的多重标记，在这种情况下，你只能选择免疫荧光。另外，免疫荧光更适合于需要定量分析的项目。总而言之，最适合您的系统将取决于您的实验目标。
　　Q3：多重免疫荧光技术什么时候能真正进入常规病理检测实验室？
　　A3：虽然过去几年里，多重免疫荧光技术领域发展迅速，但重点是基础科研和临床前应用，理所当然地人们会问：多重免疫荧光技术何时开始在临床上使用？南京泰立瑞开发染色试剂盒、图像采集的荧光数字病理扫描仪及分析软件，计划将其用作临床工具，以改善癌症的诊断和患者的预后。虽然这些技术能从组织中获取更多数据和信息，与目前的的病理学相比有更高的灵敏度，但如果不能真正改善患者的治疗效果或愈后，也不会被广泛采用，即使它是更新、更敏感、更准确、更可靠等。原因是，如果对一种特定的疾病仅仅有某种治疗药物治疗和无治疗药物两种选择，决策是基于二元决策（存在或不存在某标记物），那么更高的灵敏度检测只在有大量假阴性的情况下有用，而一般大量假阴性不存在。
　　重要的是，只有当更敏感和先进的诊断和组织、细胞表型分析技术显著改变了患者预后时，它才有用。我们强调如果只有一种或几种治疗方法，患者很容易被分群，那么先进技术也将几乎没有价值，也不会被广泛采用，即使它是新的、更敏感、更准确、更稳健等。此外，如果新技术更昂贵，那么该技术的引入可能会对患者治疗效果和整体医疗成本造成更糟的影响。
　　当考虑多重组织染色、成像技术并使用能够从单张样片中生成TB规模的成像数据来评估活检时，只有当这些信息给出可行动的治疗方案时，该技术才会有用、有帮助。例如肿瘤免疫治疗，其每种治疗都对个体患者及其疾病具有高度的特异性。这是一种新的治疗方式，治疗疗效将基于个人，基于个性化治疗，而不是宽泛的分类。就是说，免疫疗法不仅允许引入先进的以多重免疫荧光染色技术为代表的表征分析工具，而且免疫治疗的本质也需要它。因此，先进的多重免疫荧光染色或组织表型分析方法只会与先进、个性化的治疗方法同步使用，这一系列复杂的因素将决定患者是否适合接受一种或另一种治疗。例如，T细胞渗入肿瘤的距离可能是一种新治疗的独特生物标志物，这只能通过使用多重免疫荧光这类技术才能得到检测。
　　南京泰立瑞看到多重免疫荧光技术在病理实验室应用的趋势，许多临床病理专家认可多重免疫荧光技术的价值，而且与测序相比，目前的病理科大都开展了免疫组化染色，其病理科技术架构（FFPE）和医生理念都更适合适应多重免疫荧光技术。组化制药公司也开始在其临床试验中添加多重荧光染色组织成像数据，以确定更多关于患者的信息并对患者进行分层、分群。随着临床试验中疗效和多重染色检测指标之间的相关性越来越强，多重荧光染色技术将开始更多地融入整个临床病理组织成像工作流程中。然而，要实现这一飞跃，多重免疫荧光技术需要证明其能带来真正的经济效益和患者的治疗效果。